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      溫度梯度PCR儀和降落PCR區(qū)別大嗎

      更新時(shí)間:2016-06-27      瀏覽次數(shù):6757
        
        
        溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時(shí),為了找到*退火溫度,在一臺(tái)PCR儀上同時(shí)做多管PCR,每一管放在儀器內(nèi)不同列(有的是不同行)上,分別進(jìn)行PCR(如50℃~60℃可以分6管,分別為50,52,54,56,58,60度),zui后看看哪個(gè)溫度的效果。總之是用來進(jìn)行退火溫度優(yōu)化的。
        
        降落PCR是在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行PCR,只是每個(gè)循環(huán)的溫度不同(如每個(gè)循環(huán)降1度)。一般兼并引物用這種方法多些。
        
        設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)的程序,以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低。由于開始時(shí)的退火溫度選擇為高于估計(jì)的Tm值,隨著循環(huán)的進(jìn)行,退火溫度逐漸降到Tm值,并zui終低于這個(gè)水平,用于確保*個(gè)引物—模板雜交事件發(fā)生在zui互補(bǔ)的反應(yīng)物之間,即那些產(chǎn)生目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度zui終會(huì)降到非特異雜交的Tm值,但此時(shí)目的擴(kuò)增產(chǎn)物已開始幾何擴(kuò)增,在剩下的循環(huán)中處于*滯后(非特異)PCR產(chǎn)物的地位。由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對,在TD—PCR中應(yīng)用熱啟動(dòng)技術(shù)。設(shè)計(jì)時(shí),退火溫度的范圍應(yīng)跨越15℃左右,從高于估計(jì)Tm值至少幾度到低于它10℃。例:一對沒有簡并的引物—模板的計(jì)算Tm值為62℃。則:從65℃—>50℃(每2cycles降退火溫度1℃),再在50℃退火溫度下做15個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中如持續(xù)出現(xiàn)假象帶(雜帶),則是因?yàn)槠鹗纪嘶饻囟忍停蚰康臄U(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無幾,或非目的擴(kuò)增物以更高的擴(kuò)增效率擴(kuò)增,可把退火溫度每降低1℃所需的循環(huán)數(shù)增加到3或4。
        
        

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